一、涂片、干燥、固定、初染(媒染）、脫色、復(fù)染(1) 涂片：臨床標(biāo)本或液體培養(yǎng)物可直接涂抹于潔凈的載玻片上，固體培養(yǎng)的細(xì)菌先在玻璃片上滴一滴生理鹽水，然后取菌少許在鹽水中磨勻，呈輕度混濁。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右為宜。

　　(2)干燥  涂片建議在室溫下自然干燥，或?qū)?biāo)本面向上，置于酒精燈火焰高處慢慢烘干，切不可在火焰上燒干。

　　(3)固定  細(xì)菌的固定常用火焰加熱法，即將上述已干的涂片在火焰中迅速通過(guò)3——5次，溫度以手能摸時(shí)熱而不燙為度。目的在于殺死細(xì)菌，凝固細(xì)胞質(zhì)，改變細(xì)菌對(duì)染料的通透性。

　　(4) 初染：不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆蓋菌膜為度。

　　(5) 媒染：通過(guò)媒染可增加染料和被染物質(zhì)的親和力。媒染劑還可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。

　　(6) 脫色：此步驟主要目的是觀察細(xì)菌與染料間結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。

　　(7) 復(fù)染：細(xì)菌初染色被脫色后常以復(fù)染液復(fù)染，便于觀察。復(fù)染液的顏色與初染液有明顯不同。

　　二、常用染料原液配制

　　一般制備100ml純酒精飽和溶液所需染料量：美蘭2g——5g；結(jié)晶紫7g——14g；堿性復(fù)紅3g——7g。

　　三、常用的染色方法

　　1、單染色法  即用一種染料染色的方法。常用呂氏美蘭或稀釋石炭酸復(fù)紅染液。

　　染液 ：①呂氏美蘭液，美蘭酒精飽和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成；②稀釋石炭酸復(fù)紅液  堿性復(fù)紅酒精飽和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸餾水作10倍稀釋即成。

　　2、菌種：大腸埃希菌普通斜面培養(yǎng)物。

　　3、染色方法：于已做好的涂片上滴加呂氏美蘭或稀釋石炭酸復(fù)紅染液，染色1min，以水沖洗至無(wú)顏色流下為止，自然干燥或以遠(yuǎn)火烘干后鏡檢。

　　4、結(jié)果：以美蘭染色者菌體呈現(xiàn)蘭色；以稀釋石炭酸復(fù)紅染色的菌體呈現(xiàn)紅色。同。